什么是股市杠杆 【研究综述】秀丽线虫面对压力胁迫时的抗逆性_试验_诱导_氧化

秀丽线虫（Caenorhabditis elegans，以下简称“线虫”）是一种重要的模式生物，它具有许多有用的生物学特征什么是股市杠杆，例如快速发育和衰老速度、简单的培养条件和遗传可操作性等。其可用于分子遗传学、发育生物学、神经科学和细胞生物学等研究。本文我们将着重讲述线虫的抗逆性研究，一起来看看线虫在面对体内或体外的压力胁迫时会有什么表现吧。

非生物胁迫

研究胁迫抗性提供了一系列关于个体内在或外在与生物过程相互作用的宝贵信息，其中蕴含了细胞自我调节代谢路径。这里小编将描述使用存活率试验衡量线虫抵抗各种非生物胁迫，如氧化胁迫、低氧胁迫、高氧胁迫、热冷、高渗、紫外辐射、内质网非折叠蛋白应激和重金属胁迫。

氧化胁迫

在氧化应激条件下，存活率试验为我们提供关于生物系统对氧化胁迫做出响应的关键数据。线虫氧化应激试验是通过使用各种能生成活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的化学试剂。氧化胁迫试验除了需要使用ROS化学试剂处理和试验处理时限外，总体流程跟其他寿命试验相似。但由于化学试剂的毒性，氧化胁迫抗性的试验相较于寿命试验而言是在比较短的时间内完成的。因此，死亡的线虫应该在较短的时间间隔内（比如每1～2h）计数以获得适当的存活曲线用于统计分析。

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对特定的ROS试剂性质的理解有助于我们设计正确的氧化应激试验。百草枯（paraquat）是一种可以用于除草剂的有机化合物，它能产生超氧阴离子（O2-）。在实验室中，百草枯作为氧化应激的诱导剂被广泛使用。过氧化氢（H2O2）通常作为漂白和去污试剂。叔丁基过氧化氢（Tert-butyl hydroperoxide，t-BOOH）是一种高活性和毒性的有机过氧化物，其作为自由基聚合反应的引发剂。亚砷酸盐（Arsenite）可阻断丙酮酸脱氢酶反应，并通过增加细胞内的ROS水平破坏细胞内的能量生成系统。胡桃醌（Juglone）是一种形成半醌自由基的高毒性的有机化合物，它通过产生大量的超氧化物阴离子自由基诱导细胞死亡。

但最近有学者研究表明在多个物种中低浓度的ROS生成试剂反而能够延长寿命。比如，低浓度百草枯（0.015~1 mM）能延长线虫寿命，但高浓度百草枯（4~64 mM）降低线虫寿命。这结果反映了一种倒U型百草枯剂量依赖的寿命曲线。所以，我们必须在选择ROS诱导试剂用于寿命和氧化应激抗性试验前对ROS诱导剂的浓度进行效果测试。

低氧和高氧胁迫

氧气对好氧生物来说是必需的，动物有一套适应不同氧气水平的系统。低氧和高氧胁迫是将生物体分别暴露在非正常低水平或者高水平的氧气浓度中。线虫对低氧和高氧均能做出反馈，并表现为存活率变化。学者们发现氧气胁迫中一些关键的遗传因子，比如低氧诱导因子（HIF-1）。HIF-1主要掌控调节细胞内对低氧胁迫的反馈。

低氧胁迫能够用两种不同的方式进行诱导，即物理诱导和化学诱导方法。物理诱导通常将线虫置于一个密闭的低氧箱中（＜0.2% O2），同时不断地填充无氧气的气体，比如CO2、H2和N2。化学诱导法则是使用新鲜配制的0.5M 叠氮钠（sodium azide）处理线虫，叠氮钠会通过抑制线粒体呼吸链复合物IV引起细胞内的缺氧反应。线虫在暴露于低氧胁迫一段时间后，转移到正常室内环境中的NGM平板上进行恢复，在有规律的间隔时间内（比如若干小时）计数死亡线虫的数量。高氧胁迫通过往密闭的培养箱中填充60% O2，在有规律的间隔时间内（比如每隔1～3d）计数死亡线虫的数量。

热胁迫

环境温度过高会引起机体中大分子化合物结构和功能损伤，造成动物生理紊乱。在线虫中，高温会引起细胞损伤，比如神经元退化和热诱导的细胞坏死。线虫自身有一套调节系统用于保护细胞免于受到高温带来的有害影响。热休克转录因子（HSF-1）和DAF-16/FOXO转录因子能上调分子伴侣表达，降低线虫细胞内非正常蛋白积累，有助于维持细胞内蛋白稳态。热胁迫抗性试验为研究人员提供了一种可鉴定调节蛋白稳态的细胞因子方法。

线虫典型的急性热胁迫抗性（耐热性）是在35℃。在这个高温条件下，线虫移动速度缓慢且在数小时内开始死亡，使用野生型线虫做耐热性试验通常在24h内完成。耐热性试验需要精确的温度控制系统，培养箱内不精确的温度分布或者试验之间很小的温度差异均会引起存活率的巨大变化。

冷胁迫

线虫同样展示出应对低温的生理调节能力。比如，在低温条件下通过增加细胞膜不饱和脂肪酸的总体比例以保护细胞膜的流动性。使用线虫做耐冷试验有助于帮助我们认识调节冷适应性的重要机制，比如脂质稳态等。

线虫耐冷试验温度一般在0~4℃的特殊温度范围内，选取同步化L4线虫或者年轻成虫（young adult）。试验温度应该避免低于0℃，否则线虫会因被冻住而导致死亡。对于耐冷试验的存活率统计与其他存活率试验一样，线虫在暴露于特定的低温条件下一段时间后再转移至正常的培养条件温度下（20℃或25℃）恢复20min至1h，死亡的线虫将被计数。这中间的时间间隔取决于试验的温度条件，0~2℃时须数小时，4℃则可能要隔天。

高渗胁迫

在自然环境下，动物通常暴露于各种各样的渗透压力中。高渗会诱导水分流出和蛋白聚集，最终导致机体损伤和蛋白质紊乱。生物体具有多种保护细胞内渗透压平衡的机制，包括增加作为分子伴侣的渗透压调节溶质（甘油、山梨醇、纤维醇和海藻糖）的浓度，以及诱导保护渗透压基因的表达。

高渗胁迫抗性试验一般是在包含多种NaCl浓度（从50~500mM不等）的NGM培养基中完成的，选取的是20℃下的L4线虫或者年轻成虫。高渗胁迫反馈试验分为急性（3～5min）或慢性（数小时至数天）过程。死亡线虫计数的时间间隔取决于NaCl的浓度和使用的线虫品系。

UV胁迫

对于大多数陆生动物来说，紫外辐射（波长在100~400nm）是环境中主要破坏DNA的应激因素。UV胁迫诱导DNA损伤以及产生损坏细胞内其他大分子的自由基。大多数生物具有保护紫外线辐射的机制，比如受损DNA的核苷酸切除修复机制。

因为紫外辐射对人也会引起有害影响，所以研究者在进行紫外光胁迫试验时应当小心避免被照射。不能使用液体培养系统进行实验，因为液体会吸收紫外线，降低辐射剂量效应。紫外光对线虫的健康和存活率的影响具有剂量依赖效应，大多数情况下，试验剂量在10至30 J/m2/min之间，但部分特殊的紫外辐射剂量选择取决于需要解决的研究课题以及所用线虫品系的特性。紫外线辐射的存活率试验可以使用不同阶段的线虫以确定辐射对特定阶段线虫的影响。

内质网非折叠蛋白胁迫

蛋白稳态对细胞功能和存活是必需的。非折叠蛋白反应（UPRs）是一种维持蛋白稳态的关键防御机制，它可由多种环境胁迫或者在胞质、内质网和线粒体中发生的遗传扰动诱发。每一个UPR信号可以从特殊细胞隔间（compartment）传递至细胞核。进化保守的部分信号因子，如IIS、TOR和AMP激酶都能调节蛋白稳态胁迫反应。在这些UPR中，我们重点关注内质网（ER）胁迫试验。

非折叠蛋白在内质网中积累可作为一种胁迫信号被传递至细胞核。具有代表性的内质网胁迫诱导试剂是衣霉素（tunicamycin）和二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）。衣霉素广泛被用于抑制N-糖基化并阻断GlcNAc磷酸转移酶（GPT），引起细胞内质网中未折叠糖蛋白积累并诱导内质网应激。典型的内质网胁迫试验是将线虫放在含有衣霉素的OP50-NGM平板上培养数小时。衣霉素是不溶于水的，因此需要使用偶极溶剂如二甲基亚砜（DMSO）溶解。二硫苏糖醇（DTT）是一种还原剂，能阻断细胞内蛋白二硫键形成并即刻诱导内质网胁迫反应。基于DTT的内质网胁迫中，可以在OP50-NGM平板上用DTT处理线虫。

重金属胁迫

非必须重金属是指比重大于5 g/cm3的金属元素，比如镉（Cadmium，Cd）和砷（Arsenic，As）。这些重金属对生物体产生有害影响，造成蛋白功能和结构改变或产生ROS。重金属的生物蓄积会引起严重的人类疾病，例如中毒、肾功能不全和中枢神经损伤等。重金属解毒方法是使用含有大量半胱氨酸残基的金属硫蛋白，它可通过螯合重金属离子来保护细胞。使用线虫做重金属胁迫试验有助于我们发现人类相关疾病的病因，而这些因子在进化上均有良好的保守性。

对于线虫的重金属胁迫试验，常用的处理方式是将金属盐溶解并与培养基混合。试验中常用的不同盐离子浓度和处理时间如下：CdCl2（30μM~7 mM）处理8至24 h，NaAsO2（100μM~1mM）、CuCl2（4mg/ml）处理6至16h，ZnSO4（0.4mM~49.5mM）处理6 h至数天。因为不同金属具有不同的致死剂量，在进行特定的试验前应当进行实验条件优化。另外，操作这些试验的人员应该相当谨慎，因为重金属对人的健康是有害的。

Ø 病原生物抗性

病原生物抗性的存活率试验为我们提供有关于宿主防御机制以及病原生物与宿主之间拮抗关系的重要信息。理解病原生物引起的发病机制能够帮助我们制定预防和处理感染的策略。包括细菌在内的各种病原生物被用于以线虫为宿主模型的致病菌抗性试验及其毒性演变能力。同时，最近出现的感染性寄生虫（microsporidia，微孢子虫）和病毒（Orsay virus）使线虫作为这些病原体模式宿主的研究成为可能。

图2 线虫病原生物抗性试验

细菌病原体

细菌病原体大抵上可以归为两类：革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种广泛存在的，引起条件性和机会性感染的革兰氏阴性菌，它是在线虫致病体抗性试验中被普遍使用的模式病原体。沙门氏菌，包括肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是另外一些常被用到的革兰氏阴性病原体细菌。细菌可以在富含营养的脑心浸液肉汤（brain-heart infusion，BHI）培养基上培养细胞，并用于病原体抗性试验。粘质沙雷菌（Serratia marcescens）、鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）、发光杆菌（Photorhabdus luminescens）和类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）是其他一些受关注的革兰氏阴性病原体。多种革兰氏阳性病原体如金黄色酿脓葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）和细小棒状杆菌（Microbacterium nematophilum）被用于病原体抗性试验。因为大多数使用病原体进行的线虫存活率试验方法总体上是相似的，所以我们这里以绿脓假单胞菌为例简单概要。

绿脓假单胞菌通过两种显著不同的机制杀死线虫：第一种方法是定殖肠道内的细菌通过群体感应（Quorum sensing）及产生多种毒性因子杀死线虫；另一种是绿脓假单胞菌通过分泌致死毒素在24h内快速杀死线虫。结合上述两种机制，可以建立两种试验流程，即慢速杀死（slow-killing）和快速杀死（fast-killing）试验。对于慢速杀死，绿脓假单胞菌PA14（一株最被广泛使用的菌株）在低渗琼脂糖培养基上生长；相反地，在高渗培养基上生长的PA14用于快速杀死试验。最近开发的另一种试验方法是依赖于营养贫瘠的液体培养基的线虫杀死试验，在该液体试验中线虫会在48h内被PA14杀死。

在上面描述的试验方法中，使用绿脓假单胞菌进行慢速杀死是一种普遍被采用的存活率试验。慢速杀死试验又可以分为两个亚类：小菌苔试验（“small-lawn” assay）和大菌苔试验（“big-lawn” assay）。小菌苔试验是准备小体积菌液（例如每个35mm平板上滴4~10μl菌液）滴在小面积琼脂面上；大菌苔试验是准备大体积菌液（例如每个35mm平板上滴12~20μl菌液）铺满整个琼脂平板。小菌圈试验相较于大菌圈试验更加普遍。与小菌圈试验不同，在大菌圈试验中线虫没有回避PA14的空间。小菌圈试验和大菌圈试验有助于鉴定不同的病原体抗性机制（比如：病原体回避行为vs先天免疫）。

在PA14缓慢杀死的存活率试验中有几个具体的细节应当值得注意：1）由于细菌群体感应，PA14的浓度将影响细菌的毒力。因此，适当的培养温度和培养基成分以及新鲜滴定的菌圈平板对完成一次可靠的试验是非常重要的。2）选择适合发育阶段的线虫用于试验是很关键的，普遍的选择是年轻成虫和L4幼虫。3）由于普遍存在虫卵在母虫内部孵化的现象，推荐使用FUdR处理。4）应当每6～12h对死亡线虫进行计数，因为死亡的线虫会被PA14分泌的胞外酶快速溶解成透明状。

真菌

部分有能力感染和杀死线虫的机会性感染真菌病原体也可以用于病原抗性试验。其中包括新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）、白念珠菌（Candida albicans）和圆锥掘氏梅里霉（Drechmeria coniospora）。使用线虫作为宿主的真菌致病机制研究表明，真菌毒性因子作用在线虫和哺乳动物之间存在广泛的相似性。这里，我们介绍部分新型隐球菌的线虫存活率试验信息。

新型隐球菌是一种人类机会性感染的兼性细胞内病原真菌。其各种已知的毒素因子（漆酶、多糖荚膜）和影响毒性的级联转导信号已被验证。该真菌在线虫的胃肠道中堆积进而杀死线虫。在病原体抗性试验中，28℃条件下的新型隐球菌可以用YPED液体培养基培养48h。然后将真菌培养物涂布在BHI或NGM平板上并过夜培养。最后再将线虫转移到含真菌的平板上，在25℃条件下完成试验。

细胞内寄生虫

微孢子虫（Nematocida parisii）是一种可杀死线虫的细胞内病原生物。N. parisii以孢子的形式存在在线虫的肠道外，这种孢子含有细胞核和一种可以将细胞核注入宿主细胞的特殊结构——“极管”。然后，N. parisii开始在肠道细胞中生长并打乱细胞骨架结构，随后生成的孢子通过又平行感染邻近的细胞。有趣的是，线虫抵抗N. parisii感染的反馈明显不同于真菌和细菌病原体。这些为我们在比较相关的病原体和免疫机制中提供了独特的见解。

在N. parisii杀死试验中，将感染的线虫放在含有碳化硅株的微量离心管中并通过旋涡振荡的方式分离可获得寄生虫。而后再经滤纸过滤，将提取物添加到OP50-NGM平板上。与其他病原体抗性试验相似，以L4或者年轻成虫作为存活率试验的侵染对象，大约间隔适当时间（如6～12h）培养以用于试验。

综合全文，我们可以线虫在面对不同条件的压力胁迫中表现出了不同的生理特征，研究者可以通过这些特定类型的生存试验来分析其中的基本原理，为人类的相关疾病提供关键参考。正如在过去40年里取得的许多重要发现所显示的那样什么是股市杠杆，利用秀丽隐杆线虫进行的生存试验将继续引领人类解开对动物生理学至关重要的新型调节机制的道路。

参考文献：Park HH, Jung Y, Lee SV. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Mol Cells. 2017;40(2):90-99. doi:10.14348/molcells.2017.0017发布于：福建省